Molekylærbiologiske metoder for forskning og bruk

Molekylære biologiske forskningsmetoderspille en viktig rolle i moderne medisin, rettsmedisin og biologi. Takket være fremskritt i studien av DNA og RNA, er en person i stand til å studere genomet i kroppen, identifisere det forårsakende middelet, gjenkjenne den ønskede nukleinsyren i en blanding av syrer, etc.

Molekylære biologiske forskningsmetoder. Hva er det

Tilbake på 1970- og 1980-tallet var forskere de første til å lykkeså dechiftere det menneskelige genomet. Denne hendelsen ga impuls til utviklingen av genteknologi og molekylærbiologi. Studien av egenskapene til DNA og RNA har ført til det faktum at nå kan du bruke disse nukleinsyrene for å diagnostisere sykdommen, studere gener.

DNA- og RNA-produksjon

Molekylære biologiske diagnostiske metoderkrever tilgjengeligheten av kildemateriale: oftere er det nukleinsyrer. Det finnes flere måter å isolere disse stoffene fra celler av levende organismer. Hver av dem har sine fordeler og ulemper, og dette må tas i betraktning når man velger en metode for å isolere nukleinsyrer i sin rene form.

1. Skaffe DNA av Marmur. Metoden består i å behandle blandingen av stoffer med alkohol, noe som resulterer i at ren DNA feller ut. Ulempen med denne metoden er bruk av aggressive stoffer: fenol og kloroform.

2. DNA-isolasjon i henhold til Boom. Hovedstoffet som brukes her er guanidintiocyanat (GuSCN). Det bidrar til avsetning av deoksyribonukleinsyre på spesialiserte substrater, hvorfra den senere kan samles ved hjelp av en spesiell buffer. Imidlertid er GuSCN en inhibitor av PTC, og selv en liten del av den, som har falt inn i det utfelte DNA, kan påvirke løpet av polymerasekjedereaksjonen, som spiller en viktig rolle når man arbeider med nukleinsyrer.

3. Deponering av urenheter. Metoden er forskjellig fra de forrige, fordi det ikke er urenheter som deponeres, ikke dehoxyribonukleinsyremolekylene selv. For å oppnå dette, bruk jonbyttere. Ulempen er at ikke alle stoffer kan slå seg ned.

4. Massescreening. Denne metoden brukes i tilfeller der du ikke trenger nøyaktig informasjon om DNA-molekylets sammensetning, men du må få noen statistiske data. Dette forklares ved at strukturen av en nukleinsyre kan bli skadet under behandling med vaskemidler, spesielt alkalier.

Klassifisering av forskningsmetoder

Alle molekylærbiologiske forskningsmetoder er delt inn i tre store grupper:

1. Amplifisering (ved hjelp av en rekke enzymer). Dette inkluderer PCR-polymerasekjedereaksjon, som spiller en stor rolle i mange av diagnostiske metoder.

2. Ikke-forsterkning. Denne gruppen av metoder er direkte relatert til driften av blandinger av nukleinsyrer. Eksempler er 3 typer blotting, in situ hybridisering, etc.

3. Metoder basert på anerkjennelse av et signal fra et probemolekyl som binder til en bestemt DNA- eller RNA-probe. Et eksempel er Hybrid Capture System (hc2) hybridiseringssystem.

Enzymer som kan brukes i molekylærbiologiske forskningsmetoder

Mange molekylære diagnostiske metoder involverer bruk av et omfattende utvalg av enzymer. Følgende er de mest brukte:

1. Restriksjonsenzym - "kutter" DNA-molekylet i nødvendige deler.

2. DNA-polymerase - syntetiserer et dobbeltstrenget deoksyribonukleinsyremolekyl.

3. Omvendt transkriptase (revers transkriptase) brukes til å syntetisere DNA på en RNA-mal.

4. DNA ligase - ansvarlig for dannelsen av fosfodiesterbindinger mellom nukleotider.

5. Exonuklease - fjerner nukleotider fra endene av deoksyribonukleinsyremolekylet.

molekylærbiologiske diagnostiske metoder

PCR - hovedmetoden for DNA-amplifikasjon

Polymeraskjedereaksjon (PCR) er aktivbrukt i moderne molekylærbiologi. Dette er en metode hvor et stort antall kopier kan fås fra et enkelt DNA-molekyl (amplifiser molekyler).

Hovedfunksjonene til PCR:

- diagnose av sykdommer

- kloning av DNA, gener.

For gjennomføring av polymerasekjedereaksjonFølgende elementer er nødvendige: det opprinnelige DNA-molekylet, termostabile DNA-polymerase (Taq eller Pfu), deoksyribonukleotidfosfater (kilder til nitrogenholdige baser), primere (2 primere per 1 DNA-molekyl) og selve buffersystemet, hvor alle reaksjoner kan utføres.

PCR består av tre trinn: denaturering, primerglødning og forlengelse.

1. Denaturering. Ved en temperatur på 94-95 grader Celsius er det en pause i hydrogenbindingene mellom to DNA-tråder, og som resultat får vi to enkeltstrengede molekyler.

2. Annealing primers. Ved en temperatur på 50-60 grader Celsius er primere festet i enden av enkeltstrengede nukleinsyremolekyler av komplementaritetstypen.

3. Forlengelse. Ved en temperatur på 72 grader, oppstår syntesen av datter-dobbeltstrengede molekyler av deoksyribonukleinsyre.

DNA-sekvensering

Molekylære biologiske forskningsmetoderkrever ofte kunnskap om sekvensen av nukleotider i deoksyribonukleinsyremolekylet. Sekvensering utføres for å bestemme den genetiske koden. Molekylær diagnostikk av fremtiden vil være basert på kunnskapen som er oppnådd for å bestemme en persons sekvens.

Følgende typer sekvensering utmerker seg: